基因組DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題分析 solarbio

洗脫產(chǎn)物的DNA量很少或沒(méi)有

所提樣品材料老化或反復(fù)凍融導(dǎo)致基因組DNA含量下降

應(yīng)選擇新鮮的樣品材料，如新鮮血液、新鮮菌液、剛離體的動(dòng)物組織或幼嫩的植物組織等，不能即時(shí)處理的樣品應(yīng)立即放入液氮或-70℃低溫保存，以免DNA降解。

樣品破壁或裂解不*導(dǎo)致基因組DNA未充分釋放

動(dòng)、植物材料應(yīng)在液氮中充分研磨勻漿，G⁺細(xì)菌、酵母等破壁較困難的樣品應(yīng)用溶菌酶、酵母破壁酶或機(jī)械方式協(xié)助破壁，不同樣品的細(xì)胞破壁方式可參照前面的詳細(xì)介紹。

樣品量過(guò)多導(dǎo)致細(xì)胞裂解不充分

加樣量過(guò)多使裂解液和樣品混合不均勻，細(xì)胞裂解不充分。不同來(lái)源樣品的加樣量請(qǐng)參照詳細(xì)操作步驟。

DNA吸附不充分

如在上吸附柱前末加無(wú)水乙醇，或用低濃度乙醇代替無(wú)水乙醇，則導(dǎo)致DNA不能充分沉淀，與硅膠膜吸附不*，因此應(yīng)在樣品裂解后加適量無(wú)水乙醇，再上吸附柱使DNA與硅膠膜充分吸附。

DNA洗脫不適當(dāng)

洗脫液pH值過(guò)低會(huì)降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間；洗脫體積若小于30μ，則不易*浸透硅膠膜，使DNA不能全部洗脫下來(lái)，因此洗脫液體積應(yīng)大于30 μl，同時(shí)如洗脫液體積過(guò)大，超過(guò)200μl，則所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少；洗脫時(shí)可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率，提高基因組DNA的產(chǎn)量。

提取的基因組DNA有降解

選取的材料不新鮮或反復(fù)凍融，采集材料后未及時(shí)處理或末低溫保存

陳舊血液、老化菌液等不新鮮的材料中，細(xì)胞凋亡導(dǎo)致DNA降解，或低溫保存的樣品反復(fù)凍融導(dǎo)致細(xì)胞破碎，內(nèi)源核酸酶降解DNA，因此應(yīng)選擇新鮮的材料樣品，不能及時(shí)處理則低溫保存，運(yùn)輸過(guò)程中亦應(yīng)使用干冰。

未能有效抑制內(nèi)源核酸酶作用

某些DNase含量較豐富的動(dòng)、植物組織樣品應(yīng)在液氮中研磨或勻漿，研磨過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充液氮，并在樣品末*解凍前即加入含有抑制核酸酶作用的鰲合劑的裂解液。

操作過(guò)于劇烈導(dǎo)致DNA被機(jī)打斷

預(yù)處理的樣品加入細(xì)胞裂解液后，所有操作應(yīng)盡量柔和，避免振蕩、攪拌等劇烈機(jī)械力對(duì)DNA片段的損傷。

提取的基因組DNA中有RNA污染

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有有效使用RNase A

應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作要求使用，即加入裂解液的同時(shí)加入20μl RNase A溶液，室溫放置10分鐘。

RNAase A可能失活

RNase A須在-20℃下保存，低溫保存時(shí)RNase A比較穩(wěn)定，不易失活，但如果反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致RNase A降解失活，所以應(yīng)妥善保存。

提取的基因組DNA不能順利地進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)

樣品量過(guò)多導(dǎo)致細(xì)胞裂解不充分

樣品量過(guò)多會(huì)使裂解液不能快速有效地與樣品充分混合，從而導(dǎo)致樣品裂解不*，殘留大量蛋自、多糖、脂類(lèi)等雜質(zhì)，為后續(xù)的上吸附柱分離純化造成影響。應(yīng)加入適當(dāng)量的樣品材料，具體數(shù)量請(qǐng)參照詳細(xì)操作步驟。

DNA在洗脫前有大量乙醇?xì)埩?/div>

有機(jī)溶劑乙醇可嚴(yán)重抑制內(nèi)切酶、DNA聚合酶的活性，而在DNA過(guò)柱洗滌過(guò)程中需使用含有乙醇的漂洗液，因此在洗脫DNA前，—定要充分去除殘留的乙醇，可重復(fù)離心，或?qū)⑽街糜谑覝鼗?0℃溫箱中烘干5-10分鐘，再加洗脫液。