質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題分析

未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低

大腸桿茵老化

請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新茵落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

質(zhì)?？截悢?shù)低

由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

菌體中無(wú)質(zhì)粒

有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(zhǎng)期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選所用抗生素種類(lèi)和工作濃度是否正確。

堿裂解不充分

使用過(guò)多的菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，此時(shí)可減少菌體用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。

溶液使用不當(dāng)

溶液P2和P3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫一段時(shí)間，直至溶液變?yōu)榍辶梁蟛拍苁褂谩?/div>

質(zhì)粒未全部溶解（尤其質(zhì)粒較大時(shí)）

洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。

洗脫液加入位置不正確

洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位，確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達(dá)到大洗脫效率。

洗脫液不合適

DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如TE和水；洗脫液pH值過(guò)低會(huì)降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間，當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)；洗脫時(shí)可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率。

洗脫體積太小

洗脫液體積若小于30μl，則不易*浸透硅膠膜，使洗脫效率降低；洗脫液體積若超過(guò)200μl，則所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少。為了得到較高的洗脫效率可以適當(dāng)增大洗脫液體積。

洗脫時(shí)間過(guò)短

洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有—定影響，洗脫時(shí)放置2分鐘可達(dá)到較好的效果。

堿裂時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘。

質(zhì)粒純度不高

混有蛋白

菌體不要過(guò)量。經(jīng)溶液P1、P2和P3處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除。

混有RNA

RNase A處理不*，請(qǐng)減少菌體用量或加入溶液P3后室溫放置一段時(shí)間。若溶液P1已保存6個(gè)月以上，請(qǐng)?jiān)谌芤篜1中添加RNaseA。

混有基因組DNA

加入溶液P2和P3后應(yīng)溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液P2后過(guò)于粘稠，無(wú)法溫和混勻，請(qǐng)減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過(guò)16小時(shí)。

含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過(guò)程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和*0。

質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式

是在質(zhì)粒復(fù)制過(guò)程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測(cè)出多條條帶，單酶切處理后可變成單一條帶。

乙醇?xì)埩?/div>

漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除柱中殘留液體，并晾干吸附柱。如果DNA已經(jīng)洗脫出來(lái)，可以用酒精沉淀DNA并風(fēng)干，然后再溶解。